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Prohibitin 유전자 발현양 검출 역전사 중합효소연쇄반응 키트 개발 및 검사성능 평가
Development and Performance Evaluation of a Quantitative Reverse Transcription PCR Kit for the Determination of prohibitin Gene Expression
1전남대학교 의과대학 두뇌한국21 플러스사업
2광양사랑병원 진단검사의학과
3전남대학교 공과대학 전자컴퓨터공학부
4동신대학교 한의과대학
5화순전남대학교병원 진단검사의학과·전남대학교 의과대학 진단검사의학교실
1Brain Korea 21 Plus Project, Chonnam National University Medical School, Gwangju, Korea
2Department of Laboratory Medicine, GwangYang Sarang General Hospital, GwangYang, Korea
3School of Electronics and Computer Engineering, College of Engineering, Chonnam National University, Gwangju, Korea
4College of Korean Medicine, Dongshin University, Naju, Korea
5Department of Laboratory Medicine, Chonnam National University Medical School and Chonnam National University Hwasun Hospital, Hwasun, Korea
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Lab Med Online 2020; 10(3): 214-220
Published July 1, 2020 https://doi.org/10.3343/lmo.2020.10.3.214
Copyright © The Korean Society for Laboratory Medicine.
방법: TaqMan법을 적용하여 one-step RT-qPCR키트를 개발하였다. 정상인 20명의 말초혈액검체, 급성골수성백혈병 20예, 만성골수성백혈병 13예, 급성림프구성백혈병 7예의 진단시 골수검체와 상품화된 인간유래 RNA 관리물질을 이용하여 개발된 키트의 검사능 평가에 이용하였다.
결과: 개발한 PHB1 및 PHB2 RT-qPCR 키트의 측정내 정밀도와 측정 간 정밀도는 모두 2% 이내의 매우 양호한 정밀도를 보였다. 급성골수성백혈병, 만성골수성백혈병 및 급성림프구성백혈병환자에서 PHB1 유전자 발현량은 각각 0.898-0.993, 0.817-0.976, 0.844-1.074이었고, PHB2 유전자 발현량의 분포는 각각 0.957-1.024, 0.988-1.047, 0.937-1.059이었다. 개발한 PHB1 및 PHB2 유전자 정량 발현량 검사키트의 백혈병에 대한 민감도, 특이도, 양성예측률, 음성예측률 및 검사효능은 각각에서 50% 이상이었다.
결론: 본 연구에서 개발한 PHB1 및 PHB2 유전자 정량발현 one-step RT-qPCR 검사키트는 백혈병 등 혈액암의 진단 및 잔류병소 측정뿐만 아니라, 비만 등 만성대사/염증성질환이나 당뇨병 등의 추적검사 및 새로운 병태생리 규명을 위한 연구에 유용하게 사용될수 있을 것으로 판단된다.
Methods: TaqMan chemistry was used to develop the one-step PHB1 and PHB2 RT-qPCR kit. Normal peripheral blood cells from healthy individuals (N=20) and leukemia cells from patients initially diagnosed with acute myeloid leukemia (AML, N=20), chronic myeloid leukemia (CML, N=13), and acute lymphoid leukemia (ALL, N=7) were enrolled to evaluate the laboratory performance of the kit using commercially available total human RNA controls.
Results: The intra-assay and inter-assay precision of the kit developed in this study was less than 2%. The distribution of PHB1 mRNA expression of AML, CML, and ALL was 0.898-0.993 (median: 0.936), 0.817-0.976 (0.918), and 0.844-1.074 (0.973), respectively. The distribution of PHB2 mRNA expression of AML, CML, and ALL was 0.957-1.024 (median: 0.985), 0.988-1.047 (1.002), and 0.937-1.059 (1.004), respectively. The sensitivity, specificity, positive and negative predictive value, and test effectiveness of the developed PHB1 and PHB2 kit were greater than 50% for each parameter.
Conclusions: Our developed kit would be useful for diagnosing leukemia as well as detecting residual disease. Additionally, this kit could be used for monitoring and conducting molecular pathophysiological studies of obesity, metabolic, and inflammatory diseases.
Keywords
Prohibitin (PHB) 단백질은 세포 내 미토콘드리아와 핵, 세포질, 세포막 등에 존재하며, 기본적으로 미토콘드리아의 기능 및 형태 유지에 매우 중요한 역할을한다고 알려져 있다[1].
종양발생과 병태생리에
1. PHB1 및 PHB2 유전자 정량검출 역전사 중합효소연쇄반응 키트 제작
PHB 유전자 발현량 정량검출을 위한 역전사 중합효소연쇄반응 키트는 TaqMan 화학 기술을 기본으로 하여 개발하였다.
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Table 1 . Nucleotide sequences for primers and probes
Primers/Probes Sequence* PHB1 Probe[FAM]TGTGGXXXXXXXXXXCAGAGCTG[EBQ] PHB1 ReverseGGAGXXXXXXXXAACTCTG PHB1 ForwardCTGGXXXXXXXXGTGGTCGA PHB2 Probe[TET]TGACATXXXXXXXXXXCCTCGA[EBQ] PHB2 ReverseCTTGGTXXXXXXXXCCCATT PHB2 ForwardCGAGAXXXXXXXXCAGGG ABL Probe[FAM]TCTAAXXXXXXXXAAAGGT[EBQ-dT]GAAAAXXXXXXXXTCTT[Phosphate] ABL ReverseAAAATGXXXXXXXXCTTTTCG ABL ForwardCCATTCCXXXXXXXXATTATAGC *X represents nucleotides hidden for security reasons.
2. 검체와 인간유래 RNA 관리물질
신체검사와 다양한 검사를 통해 정상으로 판명된 20명의 말초 혈액을 채혈하여 정상인에서
개발된 키트의 검사능 평가를 위해, 추가적으로 상품화된 인간유래 RNA 관리물질(Thermo Fisher Scientific)을 이용하였다. 환자유래 검체는 검사 후 잔여검체로부터 획득하여 사용하였고, 이와 관련하여 기관윤리위원회 승인(CNUHH-2019-001)을 얻어 본 연구를 수행하였다. 한편 본 연구는 임상검사 후 폐기예정인 잔여검체를 이용하는 연구로서 체외진단용 의료기기 임상시험 피험자 동의면제 요건에 해당됨을 기관윤리위원회로부터 승인받았다.
3. 검사성능 평가
검출 한계를 결정하기 위하여 위의 표준물질(2×105 copies/μL)을 이용하여 DEPC 처리 증류수로 희석하여 2×104 copies/μL, 2×103 copies/μL와 2×102 copies/μL 농도의 희석액을 만들어 사용하였다. 각 농도당 4번 반복검사를 실시하여 검출한계를 검증하였다. 특이도 평가를 위해 정량증폭 음성 대조검체로서 DEPC처리 증류수를 사용하였다. 양성 대조검체로는 상품화된 인간유래 total RNA control (ThermoFisher Scientific)을 이용하였다. 정밀도 평가는 상품화된 인간유래 total RNA control (ThermoFisher Scientific)을 이용하여, 측정 내 정밀도(intra-assay precision)와 측정간 정밀도(inter-assay precision) 평가를 위해 4일간 하루 10번씩 반복검사를 수행하여 평가하였다.
검사능 분석은 병원종사자와 검진센터에서 혈액검사를 포함하여 다양한 검사에서 비정상적인 소견이 관찰되지 않은 정상인 20 명의 혈액검체를 이용하여
4. 백혈병환자 검체 적용
개발한 GeneMediKit®
5. 통계분석
통계분석에 이용한 통계 소프트웨어는 SPSS version 13.0 (SPSS Inc., Illinois, USA)을 이용하였다. 직선성을 평가하기 위해 다항회귀분석을 시행하였고,
1. 키트 개발 결과
본 연구에서 개발된 키트는 검사현장에서 이용되는 실시간 중합효소연쇄반응기인 CFX96 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 ABI 7500 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)에 바로 적용할 수 있게 하였다. 설명서에 명시된 반응액의 조성은 시발체와 프로브 혼합물(5 μL), 2x RT-qPCR 반응액(12.5 μL), 증류수(2.5 μL), ROX 형광물질(0.5 μL, ABI 7500 사용할 경우에 추가), 그리고 검체에서 추출한 RNA (5 μL)이다. PCR 반응 조건은 역전사반응 과정을 위해 50°C에서 30분간 반응시키고, 95°C에서 5분간 변성(denaturation) 과정을 거친 후, 95°C에서 20초, 55°C에서 30초 반응을 40회 수행하는 과정으로 구성되었다.
개발된 키트에는 내부대조
2. PCR 증폭효율평가
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Figure 1. Amplification plots of standards for
ABL (upper panel),PHB1 (middle panel), andPHB2 (lower panel) genes. Five standards ofABL ,PHB1 , andPHB2 genes were used in each experiment with the same number of copies (Standard 1: 2×102 copies/μL, Standard 2: 2×103 copies/μL, Standard 3: 2×104 copies/μL, Standard 4: 2×105 copies/μL, Standard 5: 2×106 copies/μL).
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Figure 2. Theslope of the standard curve used toestimate PCR amplification efficiency of
ABL (upper),PHB1 (middle), andPHB2 (lower) genes. A standard curve is graphically represented as a semi-log regression line plot of the Cq value versus log of standard nucleic acid copies.
3. 검출한계 평가
검출한계를 검증하기 위해 시행한 검사에서 GeneMediKit
4. 특이도 평가
개발한 키트를 사용하여, 양성 대조검체로 사용한 상품화된 인간유래 total RNA control로써
5. 정밀도 평가
상품화된 인간유래 total RNA control (ThermoFisher Scientific)을 이용하여 검증한 측정내 정밀도는
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Table 2 . Precision evaluation of the GeneMediKit®
PHB1 andPHB2 RT-qPCR using human total RNA as a controlGene Test No. Intra-assay precision Inter-assay precision Mean SD CV Mean SD CV PHB1 40 0.983 0.010 1.095 0.983 0.011 1.150 PHB2 40 0.890 0.014 1.613 0.891 0.015 1.689
6. 정상인 및 백혈병환자에서 PHB1 및 PHB2 유전자 발현양
정상인과 각종 백혈병환자에서
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Figure 3. Distribution of
PHB1 andPHB2 mRNAexpressionin healthy individuals and individuals with acute myeloid leukemia (AML), chronic myeloid leukemia (CML), and acute lymphoid leukemia (ALL).*,P <0.05.
7. 검사능(진단효율)검증
GeneMediKit®
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Table 3 . Diagnostic efficacy of the GeneMediKit®
PHB1 andPHB2 RT-qPCR kitPHB1 PHB2 Leukemia (N) Healthy (N) Total (N) Leukemia (N) Healthy (N) Total (N) PHB quantificationOut of RI (+) 25 4 29 32 5 37 Within RI (-) 15 15 30 8 12 20 Total (No) 40 19 59 40 17 57 Laboratory performance for leukemia Sensitivity 62.5 80.0 Specificity 78.9 70.6 PPV 86.2 86.5 NPV 50.0 60.0 TE 50.4 53.1 Abbreviations: RI, reference interval; PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive value; TE, test effectiveness.
PHB 단백의 기능은 세포내 존재 위치에 따라 그 기능이 결정된다.
종양발생을 포함한 종양병태생리에서
한편, Mishra와 Nyomba의 연구에서는, 생쥐의 지방조직과 대식세포에서 야생형(wild-type)
PHB는 진화론적으로 잘 보존된 세포내 단백으로서 핵, 세포질 및 세포내소기관등 다양한 세포내 부위에서 다양한 기능을 갖는다.
본 연구는 2018년 과학기술정보통신부 기술이전 사업화 사업과 한국연구재단 이공학 개인 기초학술연구비(NRF-2018R1D1A1B07040984 및 NRF-2019R1F1A1059859) 일부 지원으로 수행되었습니다.
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