RhD 혈액형은 적혈구 표면 D 항원의 발현 정도에 따라 D 항원이 정상적으로 발현된 D 양성, 발현되지 않는 D 음성, 양적 감소나 질적 결손이 발생한 D 변이형으로 분류할 수 있다. 혈청학적 검사로 분류된 RhD 음성의 발생 기전은 인종마다 다양하다. 유럽인은 RHD 유전자의 완전 결손(total deletion), 아프리카인은 RHD 위유전자(RHD pseudogene)가 대부분이며[1, 2], 한국인은 RHD 유전자의 완전 결손이 74.2%, 점돌연변이가 17.1%, 그리고 하이브리드형(RHD-CE-D hybrid)은 8.7%였다[1]. 하이브리드형은 부분-D 형과 RhD 음성을 유발하는 기전으로 알려져 있는데, RhD 음성을 유발하는 경우 그간 보고된 바에 의하면 모두 RHD-CE(2-9)-D로 알려져 있고 그 외의 하이브리드형은 국내에서 보고된 바가 없다[1].

이에 저자들은 혈청학적 검사에서 D 음성을 보인 30대 환자에서 RHD-CE(3-8)-D 유전형을 새롭게 발견하였기에 국내에서 처음으로 보고하는 바이다.

30대 남자 환자가 심부전으로 외래 방문하였다. K2-EDTA 튜브의 정맥혈 검체를 이용하여 자동화 장비(QWALYS-3 system; DIAGAST, Loose Cedex, France)로 실시한 혈액형 검사는 A형, RhD 음성이었다. RhD 혈액형에 대한 추가 분석을 위해 시행한 RhCE 표현형은 (anti-C, -c, -E 및 -e, Bio-Rad, Cressier, Switzerland) Cce형이었다. 약-D 검사는 클론이 다른 두 개의 제조사의 항-D 시약(SIHDIA; Shinyang Diagnostics, Siheung, Korea 및 Bioclone; Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, NJ, USA)으로 실시하였고 각각 음성, 약양성을 보였다. 그러나 약-D 검사의 음성 대조 시험(환자의 적혈구와 immuClone Rh-Hr Control; Immucor Med., Dreieich, Germany)에서도 약양성을 보여, Bioclone 시약에서 보인 약양성 반응이 위양성일 가능성을 배제할 수 없었다. 이를 확인하기 위해 DC-Screening II (Bio-Rad)를 사용하여 실시한 단특이성(monospecific) 직접항글로불린검사에서 항 IgG단특이성 시약과 약양성을 보였다. 따라서 약-D 검사 결과는 환자의 적혈구에 부착되어 있는 IgG에 의한 위양성 반응이라 판단하였다. 위양성 반응의 원인을 제거한 후 추가적인 흡착-용출 검사(adsorption-elution test) 시행을 고려하였으나 검체량이 충분하지 않아 시행할 수 없었다. 이에 제한된 검체량으로 정확한 RhD 유형을 확인하고자 RHD 유전자 검사를 우선적으로 시행하였다. DNA는 정맥혈로부터 MagNA Pure 96 DNA Isolation kit (Roche, La Roche, Switzerland)로 추출하여, RHD 프로모터, 인트론 4, 엑손 7 그리고 엑손 10에 존재하는 RHD 특이적 다형성(RHD-specific polymorphism) 여부를 확인하고자 polymerase chain reaction-sequence specific primer (PCR-SSP) 검사를 시행하였다[3]. 그 결과, 인트론 4와 엑손 7은 증폭되지 않았고 프로모터와 엑손 10이 증폭되어 전형적인 하이브리드형의 결과와 일치했다. 그러나 동시에 시행한 RHD 엑손 9번에 대한 직접염기서열분석에서, 정상 RHD 염기서열이 확인되어 한국인에서 보고되었던 전형적인 RHD-CE(2-9)-D 하이브리드형에서 예측되는 결과와 상이했다. 이에 정확한 하이브리드 유형을 동정하기 위해 RHD 유전자의 엑손 1-10과 그 주변부 인트론을 Fasano 등[4]이 사용한 것과 동일한 RHD 유전자 특이적인 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응으로 RHD 유전자를 증폭하였다. 증폭된 산물로 Seo 등[3]이 보고한 방법과 동일하게 직접염기서열분석을 실시하였다. 그 결과, 엑손 1, 2, 9, 10이 증폭되었고 엑손 3-8은 증폭되지 않았다(Fig. 1). 증폭되지 않은 엑손 3-8은 RHCE 유전자로 판단하였고 증폭된 엑손 1, 2, 9, 10의 염기서열을 표준 염기 서열인 NM_016124.4를 기준으로 분석한 결과, 돌연변이는 확인되지 않았다. 이에 본 환자는 RHD와 RHCE 유전자 사이 교차(crossing over)의 결과인 RHD-CE(3-8)- D hybrid 형이라 예상할 수 있었다. 이후 외래 재방문한 환자의 정맥혈 검체로 혈액형 검사를 다시 시행하였고, 항-D 검사와 약-D 검사, 직접항글로불린검사, 그리고 추가로 시행한 흡착-용출 검사 결과 모두 음성이 확인되어 본 환자의 표현형은 RhD 음성으로 최종 확인하였다(Table 1). 따라서 해당 환자는 RhD 음성 혈액을 준비할 예정이었으나 전혈구검사상 헤모글로빈 수치가 수혈 기준치보다 높아 수혈이 필요치 않았다.

Table 1 . Serological results of RhD typing, weak D test, and adsorption-elution test performed on the patient’s first and subsequent visits

Test	Methods	Reactivity		Brand	Clone (type)
		1st visit	2nd visit
DAT
IgG	Microcolumn	+/−	−	Bio-Rad	Polyclonal
C3d	Microcolumn	−	−	Bio-Rad	BRIC8 (IgM)
RhD typing	Microplate	−	−	Qwalys	P3X61 (IgM)
	Tube	−	−	Bioclone	MAD2 (IgM), Polyclonal
	Tube	−	−	SIHDIA	TH-28 (IgM), MS-26 (IgG)
Weak D	Microcolumn	+/−	−	Bioclone	MAD2 (IgM), Polyclonal
		−	−	SIHDIA	TH-28 (IgM), MS-26 (IgG)
	Tube	+/−	−	Bioclone	MAD2 (IgM), Polyclonal
		−	−	SIHDIA	TH-28 (IgM), MS-26 (IgG)
	Autocontrol	+/−	−	Immucor	NI
Adsorption-elution	Glycine acid	NT	−	MIRRSCITECH	NI

Abbreviations: NT, not tested; NI, no information available.

Figure 1. (A) Schematic representation of the genomic structure of RHD-CE(3-8)-D compared with intact RHD and RHCE gene. The black and white boxes represent RHD and RHCE exons 1-10, respectively. (B) PCR-SSP for RHD exon scanning. Exons 3-8 indicated by the dotted line did not result in amplification, suggesting RHD-CE(3-8)-D hybrid. Faint bands in exons 3 and 7 were considered non-specific according to (C), the expected size for amplification.

RhD 항원의 변화를 유도하는 대표적인 유전자 변이는 점 돌연변이(point mutation)와 RHD-CE-D hybrid이다. RHD-CE-D hybrid형은 RHD와 RHCE 유전자 사이 교차(crossing over) 위치에 따라 부분-D형 혹은 D 음성의 표현형을 보인다. 부분-D형은 RHD-CE(3-6)-D hybrid형이, D 음성은 RHD-CE(4-7)-D hybrid형과 RHD-CE(2-9)-D hybrid형이 대표적이다[5]. 국내에서는 RHD-CE(2-9)-D hybrid가 D 음성 표현형을 보이는 hybrid형으로 유일하게 보고 되었다[1]. 본 증례는 국내 최초로 RHD-CE(3-8)-D hybrid형을 확인하였고 해당 변이가 RhD 음성 표현형을 보인다는 것을 혈청학적으로 확인하였다.

본 증례에서 발견된 RHD-CE(3-8)-D hybrid형은 인도인[7]과 튀니지인[8]에서 보고된 바 있으며 모두 D 음성 표현형을 보였다. Wag-ner 등[5]에 따르면 세포외 도메인 중 RhD 항원과 RhCE 항원을 구별할 수 있는 RhD-특이적 아미노산(RhD-specific amino acids)은 loop3, loop4, loop7에 존재하며, 각각 엑손 4, 엑손 5, 엑손 7이 암호화하고 있기 때문에 3개의 엑손 중에 1개 이상의 엑손에 변이가 생기면 D 항원결정인자(epitope)의 질적 결손이 발생하여 부분-D형의 표현형을 보이고, 3개의 엑손 모두 변이가 생기면 D 항원결정인자가 완전히 결손된 D 음성 표현형을 보이게 된다. 따라서 RHD-CE-D hybrid형에서 적어도 엑손 4에서 엑손 7까지 RHCE로 전환(conversion) 되어야 D 음성의 표현형이 나타난다. 본 증례에서 발견된 RHD-CE(3-8)-D hybrid형은 엑손 3에서 엑손 8까지 RHCE 유전자로 전환되었기 때문에 D 음성 표현형을 보일 것으로 예상되었고, 실제로 혈청학적 검사에서 D 음성의 표현형을 보였다. 이는 약-D 검사 및 흡착-용출 시험을 통해 입증되었다(Table 1).

혈청학적 검사에서 위양성, 위음성, 검사법의 한계 등 여러 원인에 의해 RhD 음성이나 RhD 변이형 등 RhD 혈액형을 정확히 확인할 수 없을 경우에는 RHD 유전자 검사가 권고된다. 본 증례는 자동혈액형검사장비에 의해 RhD 음성, 약-D 검사에서 약양성 반응을 보였으나, 직접항글로불린검사에서도 약양성을 보여 RhD 음성과 RhD 변이형을 구분할 수 없었다. 검체의 부족으로 추가적인 혈청학적 검사를 할 수 없어 소량의 검체로도 가능한 RHD 유전자 검사를 실시하였고, RHD-CE(3-8)-D hybrid형에 의한 RhD 음성임을 확인할 수 있었다. 이는 RHD 유전자 검사를 통해서 RhD 혈액형에 대한 혈청학적 검사의 한계를 보완할 수 있는 사례였다.

RHD와 RHCE 유전자는 염기서열 간의 높은 유사성을 가지고 있으며 인접한 DNA 가닥(DNA strand)에 서로 반대 방향으로 위치하고 있어 유전자 전환이 일어나기 쉽다[5]. 이러한 전환의 결과로 발생하는 RHD-CE-D hybrid 대립 유전자는 교차 위치에 따라 적혈구 D 항원의 표현형 약화 혹은 결손을 유발한다. 본 증례에서는 중합효소연쇄반응으로 RHD 유전자 산물을 증폭하고 증폭된 산물인 엑손 1, 엑손 2, 엑손 9, 엑손 10 대해 직접염기서열분석법을 시행하여 변이가 없음을 확인하였다. 이러한 결과를 종합하여 본 환자는 엑손 3에서 엑손 8까지 RHCE로 치환되어 D 항원이 결손된 RHD-CE(3-8)-D hybrid형이라 판단할 수 있었다. 이러한 결과를 명확히 확인하고자 절단부위(breakpoint) PCR을 사용하여 염기서열 내 정확한 절단부위를 확인하는 것이 추가 연구로 필요할 것으로 생각된다. 또한 가족들에 대한 유전자 검사를 통해 본 증례에서 국내 처음으로 확인한 RHD-CE(3-8)-D hybrid 대립유전자의 유전양상을 확인하는 것 또한 도움이 될 것이다.

저자들은 본 연구와 관련하여 어떠한 이해관계도 없음을 밝힙니다.