임상검사실에서의 혈청단백 전기영동 검사는 단클론감마글로불린병증(monoclonal gammopathy)에서 혈청에 존재하는 단클론면역글로불린 단백(Monoclonal immunoglobulin protein, M단백)의 검출과 정량을 주요 목적으로 한다[1, 2]. M단백이 없는 경우에도 전통적으로 다양한 병적 상태에서 관찰되는 주요 혈청단백의 증감 양상에 따라 추정되는 환자 상태와 임상적 의의에 대해서 통합 자문적인 내용을 담아 보고하기도 하지만[3], 무알부민혈증(analbuminemia)이나 알파1-항트립신결핍증(alpha-1 antitrypsin deficiency)과 같은 매우 드문 질환에서의 특징적인 소견 및 M단백의 검출과 관련된 소견 외에 비교적 흔히 관찰되는 신증후군, 염증성 반응, 간질환 패턴(pattern)의 보고 필요성과 관련하여 임상성능 및 임상적 유용성의 근거가 부족하며, 다른 바이오마커(biomarker)들의 존재로 그 추가적인 정보의 가치가 많이 감소한 것으로 생각된다[4].

일반적으로 모세관전기영동(capillary electrophoresis, CE)이라 함은 모세관을 이용한 다양한 방식의 전기영동을 통칭하지만, 임상검사실에서 혈청단백의 분리에 이용되는 CE라 함은 체질 매트릭스(sieving matrix) 없이 지지 물질 없는 용액(free-solution)에서 분석물질을 분리하는 방식을 말하며, 모세관띠전기영동(capillary zone electrophoresis)이라 부르기도 한다[5]. 이때 띠전기영동(zone electrophoresis)이라 함은 단백 혼합물들이 비어 있는 영역을 사이에 두고 명확하게 각각의 구역으로 구분되는 것을 뜻하며, 과거의 분석물질들 간의 분리가 명확하지 않았던 경계이동전기영동(moving boundary electrophoresis)과 구별하여 부르는 말이다[6]. 임상검사실에서 혈청단백의 분석을 위한 CE 검사는 1990년대 초에 활용 가능성이 제시된 이후 1990년대 후반부터 다중 채널(multichannel) 상용화 장비가 도입됨에 따라 아가로스(agarose) 혹은 셀룰로오스아세테이트(cellulose acetate) 겔(gel) 기반의 전기영동 검사의 대체제로 본격적으로 사용되기 시작한 것으로 보인다[7, 8]. 이후 우수한 분리능과 자동화에의 용이함을 강점으로 점차 보급되어 왔으며, 2016년에 시행된 미국병리학회(College of American Pathologists, CAP)의 숙련도시험(proficiency testing)에 참여하는 검사실들을 대상으로 한 설문조사에서는 사용 중인 혈청단백 전기영동 검사법에 대한 질문에 응답한 758개 검사실 중 238개 검사실(31.4%)에서 CE를 사용하는 것으로 보고한 바 있다. 이 중 미국이 아닌 지역에서는 그 비중이 더 높아 158개 검사실 중 73개 검사실(46.2%)에서 CE를 사용하는 것으로 보고하였다[9]. 보다 최근인 2022년 시행된 CAP 숙련도시험에 참가한 기관들 중에서는 45–50%가량에서 CE를 사용하는 것으로 나타나 그 비중이 더욱 증가한 것으로 보인다. 국내 혈청단백 전기영동 검사 현황에 대한 2020년 시행된 설문연구에서는 사용 중인 검사장비에 대한 질문에 응답한 15개 기관 중 11개 기관(73.3%)이 CE 장비를 사용하는 것으로 보고하였다[10]. 이처럼 CE는 혈청단백의 분석을 위한 검사법으로 현재 국내외적으로 널리 이용되고 있다.

검사 원리와 기술적 측면에 대한 이해는 결과의 검증 및 문제 해결에 도움을 줄 수 있다. 이는 CE의 경우에도 마찬가지이다. 또한 아가로스겔전기영동(agarose gel electrophoresis, AGE)에서와 마찬가지로 CE 또한 적은 양의 M단백이 존재할 경우 불명확한 피크(peak)로 나타날 수 있으며, 정상적으로 관찰되는 주요 단백과 비슷한 이동성상을 보이는 M단백은 검출이 어렵다. 이러한 경우와 감별이 필요한 주요 단백들의 변이 양상과 M단백 이외의 흔한 이상소견을 아는 것이 판독과 후속 조치를 결정하는데 도움을 줄 수 있다[11]. AGE에 익숙한 판독자라도 CE의 경우 전기영동도(electrophoretogram) 양상과 특성이 AGE와 다소 다르므로 주의해야 하며, 같은 CE의 경우도 세부적인 방법에 따라 전기영동도 양상이 다를 수 있으므로 관찰되는 주요 이상 소견들에 대해서 자체적으로 점검해 볼 필요가 있다[12].

본 종설에서는 CE의 검사 원리를 되새긴 후 몇 가지 기술적 고려사항에 대하여 논하였다. 또한 전기영동도상의 특징과 비교적 흔히 관찰되는 M단백으로 혼동을 줄 수 있는 이상 피크(pseudo-monoclonal component)들에 대한 문헌을 고찰하며 저자들의 경험을 공유하고, AGE와 비교한 검사의 성능에 대해 언급하며 마무리하였다. 본 종설은 혈청단백 전기영동 검사에 대한 기초 지식 및 판독 경험이 있는 사람을 독자로 가정하여 기본적인 내용에 대한 설명은 생략하였다. 또한, 이전의 국내 논문과 학회 발표를 통해 비교적 자주 다루어진 M단백의 검출과 정량 방법에 대한 자세한 내용과 전형적 패턴에 대한 기술은 포함하지 않았다. 전기영동도상에서 피크의 위치에 대한 기술 시 CE상에서 음극(cathode) 쪽으로 보다 빠른 이동성을 보이는 피크를 ‘음극성(cathodic)’이라 칭하겠으며, 반대로 보다 느린 이동성을 보이는 피크를 ‘양극성(anodic)’이라 칭하겠다. 예를 들어, 양극성 감마 영역에 있는 피크라 함은 베타 영역에 가까운 쪽 감마 영역의 피크를 의미한다. M단백의 동형(isotype) 및 경쇄형(light chain type)의 확인과 보다 민감한 검출을 위한, 특이적 항혈청과의 반응과 전기영동을 결합한 방식의 검사를 포괄적으로 면역형검사(immunotyping)라 하겠으며, 그러한 면역형검사에 해당하는 AGE에서의 면역고정전기영동(immunofixation electrophoresis, IFE)과 CE에서의 면역감소법(immunosubtraction, ISUB)을 구분하여 말할 때는 각각 IFE, ISUB이라 하겠다. 여기에 제시된 전기영동도들은 저자들의 검사실에서 Capillarys 2 Flex Piercing (Sebia, Lisses, France) 장비를 이용하여 pH 9.9 붕산염완충액(borate buffer), 온도 35.5°C, 전압 7.8 kV로 약 4분간 영동하며 200 nm 파장의 흡광도를 측정한 결과를 Phoresis (Sebia; version 9.1.5) 프로그램을 통해 출력한 것이다.

1. CE의 검사 원리 및 AGE와의 주요한 차이점

혈청단백의 CE 검사는 검체가 모세관으로 주입(injection)되어 모세관 내에서 영동(migration)되며 분리(separation)된 후 모세관의 끝 쪽에서 검출(detection)되는 순서로 이루어진다. 주입 단계에서 보통 완충액에 희석된 검체를 약 1초 동안 음압으로 빨아들여 1 nL가량의 검체가 모세관에 들어간 후 다시 양쪽 끝이 완충액에 담긴 채 영동이 진행된다. 영동은 보통 15–20 cm 정도 길이의 용융실리카(fused silica)로 만들어진 내경 25 µm 정도의 모세관에서 이루어지며, 7–10 kV의 고전압에서 24–35°C가량의 온도, pH 10 정도의 알칼리 완충액상에서 2.5–4분간 진행된다[1, 7, 12]. 혈청단백들은 서로 다른 영동 속도에 따라 다른 시간에 광학 셀(optical cell)을 통과하며 검출되는데, 보통 200–210 nm 파장의 자외선 흡광도를 측정한다.

알칼리 용액에서 단백질들은 음전하를 띠게 되지만 강한 전압과 음전하를 띠는 좁은 모세관에서 발생하게 되는 음극 쪽으로의 전기삼투 흐름(electroosmotic flow)으로 인해 용액과 함께 음극 방향으로 이동하게 된다. 이때 각 단백질들이 갖는 순전하(net charge)와 크기 등에 따라 영동 속도가 달라지므로 분리가 일어난다. 이처럼 전기삼투 흐름이 전체적인 이동 방향을 결정짓는 큰 힘으로 작용하는 점이 AGE와의 차이이다. 그리고 단백질들의 이동 방향과 거리는 같은데 검출 시간이 달라지는 것으로 전기영동도상의 가로축이 AGE에서는 거리를 의미하는데 반해 CE에서는 시간을 의미하는 점이 다르다[13]. 또한 단백질에 대한 염색을 하는 AGE에 반해 CE는 펩타이드 결합(peptide bond)의 주요 흡광 파장에서 흡광도를 직접 측정함으로써 단백질마다 다른 염색성으로 인해 발생할 수 있는 정량적 오류에서 비교적 자유로울 수 있다. 하지만 이 때문에 비슷한 흡광 파장을 갖는 항생제, 조영제 등의 외인성 물질로 인한 간섭이 발생하기도 한다. CE의 전기영동도와 AGE의 농도계(densitometer)를 통해 얻어진 전기영동도는 매우 흡사하지만 이처럼 그것이 얻어지기까지의 과정은 상당히 다르다.

2. 전기영동도의 판독 전에 고려해야 할 검사 과정의 기술적 사안들

1) 가공된 곡선

AGE는 기본적으로 염색된 겔을 판독자가 시각적으로 확인하고 추가적으로 이를 농도계를 통해 디지털화하여 그래프로 전환하지만, 반대로 CE의 경우 애초에 디지털 자료로 흡광도 측정 결과가 기록되어 이를 그래프로 보여주고 추가적으로 가상의 겔 이미지로 전환하여 보여주기도 한다[1]. 구체적으로 신호를 어떻게 처리하여 전기영동도를 구성하는지에 대해서 제조사에서 공개한 자료는 없지만, Sebia Capillarys 2 Flex Piercing 장비의 백업 자료로 내보내기한 파일을 통해 전기영동도 자료에 대해 살펴보면, 세 자리 16진수(최대값 4,095)의 상대적 흡광도 값이 300개 나열된 형태로 자료가 저장되어 있다(Fig. 1A). Phoresis 프로그램에서 이 점들을 적절히 곡선화하여 보여준다. 크게 표준(standard), 다시그림(redraw; 기본값)을 선택할 수 있는데(Fig. 1B, C), 다시그림의 경우 초저밀도지단백(very low density lipoprotein) 피크를 제거하기 위해 알부민과 알파1 글로불린 사이의 일정 영역을 삭제하는 등의 보정이 적용된 것으로 보인다[14]. 평활화(smoothing)에 대한 설정을 조절할 수도 있으며, 설정에 따라 작은 피크들에 대한 검출이 달라질 수 있다(Fig. 1D). 이와 같이 CE의 경우 결과의 원본이 디지털 자료이며, 이를 적절히 가공하여 연속된 곡선으로 보여주는 것이고 이에 따른 왜곡이 있을 수 있음을 염두에 두어야 한다.

Figure 1. Electrophoretograms depending on the data processing (the result of the case with oligoclonal peaks after autologous stem cell transplantation). (A) The absorbance information from the backup data is expressed as dots. (B) The electrophoretogram of ‘redraw’ mode, which is shown by default in the Phoresis program. (C) The electrophoretogram of ‘standard’ mode with the wider gap between albumin and alpha-1 globulin peaks. (D) Changes in small peaks in gamma region according to set value for smoothing.

2) 단백 침전(precipitation)으로 인한 문제는 없는가?

CE의 경우 35도 이상의 온도에서 영동이 가능하여 AGE에서 자주 관찰되던 한랭글로불린(cryoglobulin)의 침전으로 인한 문제를 상당히 줄인 것으로 보인다[15, 16]. 하지만 주로 IgM 형태의 M단백이 있는 검체에서 발생하는 단백 침전으로 인한 문제를 배제할 수는 없다. 검출되지 않거나 감소되어 보이던 M단백이 penicillamine이나 2-mercaptoethanol (2-ME) 같은 이황화결합(disulfide bond)을 끊는 환원제 처리를 한 후 명확히 검출된 사례가 존재하고[17, 18], 온도 의존적이지 않은 pH 의존적인 침전에 의해 높은 pH의 완충액으로 검체를 희석하여 검사하는 CE에서 M단백이 검출되지 않은 사례도 존재한다[19]. 또한 한랭글로불린을 가진 검체를 냉장보관 후 검사할 경우 M단백이 침전되어 검출이 안되거나 더 적게 정량될 수 있다[14]. 따라서 CE에서도 단백 침전으로 인한 M단백의 위음성 또는 위저하 문제가 생길 수 있고, 비록 그 빈도는 드문 것으로 생각할 수 있지만 가능성에 대해서는 염두에 두어야 한다. 더욱이 AGE에서는 침전된 단백이 접종 위치(application point)에서 영동되지 않은 채 진하게 염색되어 눈에 띄는 것과 달리 CE에서는 특별한 이상 징후가 나타나지 않을 수도 있다. 따라서 비탁측정법(nephelometry) 또는 혼탁도측정법(turbidimetry)에 의한 IgM 정량 또는 다른 임상상과 CE 결과가 잘 맞지 않는 경우, 검체와 희석분절(dilution segment)에서 침전 여부를 확인하고, 검체를 가온하거나 2-ME 처리하여 재검할 필요가 있다.

3) 잔효 오염(carry-over contamination)은 없는가?

CE 검사 시 동일한 검체 탐침(sample probe)과 모세관에서 여러 검체를 다루게 되므로 검체 간 잔효 오염에 대한 우려가 있을 수 있다. 하지만 현대 CE 장비들에서는 문헌으로 보고된 잔효 오염 사례를 찾지는 못하였는데, 철저한 세척을 통해 오염을 방지하는 것으로 보인다. 다만 매우 예외적인 상황도 발생할 수 있는데, 저자들의 검사실에서 검체 탐침 상단의 누수로 인한 오염 사례가 있었다. 당시 환자검체 검사 전 시행된 정도관리 결과는 정상이었으나, 같은 랙에서 검사된 앞 환자검체의 피크가 다음 환자검체의 전기영동도에도 나타났고, 빈 랙을 채우기 위해(기기 특성상 랙을 다 채워서 영동해야 함) 넣은 증류수 검체가 혈청 패턴을 보이는 현상이 발생하였다(Fig. 2). 이러한 매우 예외적인 기기 이상을 감지하기 위해 매일 공시료를 검사할 필요성이 있을지는 의문이지만, 주기적으로 검증을 하거나 환자 결과 판독 시 다른 상황과 맞지 않는다면 오염 가능성에 대한 의심을 해볼 필요는 있다. 또한 현대 CE 장비의 경우 원검체 그대로 장비에 장착하여 검사할 수 있어 검사 전단계의 검체 조작으로 인한 문제의 빈도는 적겠지만, 바코드 훼손 및 검체량 문제 등으로 검체를 옮겨 담는 등의 조작이 필요한 예외적인 상황은 얼마든지 생길 수 있고, 이러한 과정에서 잔효 오염 문제가 발생할 수도 있다.

Figure 2. Carry-over contamination case. (A) The result of the sample suspected of contamination exhibiting two monoclonal peaks in mid-gamma and cathodal gamma region. (B) The result of immediately preceding sample in the same rack, exhibiting a large monoclonal peak in mid-gamma region. (C) The previous result of the same patient, exhibiting only one monoclonal peak in cathodal gamma region. (D) The sample probe covered with the white substance considered as the residue of the sample and buffer, suggesting a leakage.

4) 검출 구간을 벗어난 피크

CE의 임상검사실 도입 초기에 높은 등전점을 가지고 음극성 이동을 하는 M단백들이 검출되지 않은 사례가 보고된 바 있으나[20], 이후 그러한 사례에 대한 추가 보고는 없었다. 하지만 저자들의 검사실에서 음극성 감마 영역으로의 이동성상을 보이는 M단백이 일시적으로 전기영동도상에서 상당량 잘려진 결과를 보인 사례가 있다(Fig. 3). 이는 검체의 특성, 검사 수행 간 변동성, 기기 상태 등의 여러 요인이 결합되어 나타난 결과일 것으로 생각된다. 임상 검체에서 마주치는 M단백의 특성은 다양하고 기기 상태에 따라서 극단적인 음극성 피크가 잘리는 경우도 발생할 수 있으므로 음극성 끝 쪽 영역의 곡선 상승이 있을 경우 단순히 잡음으로 치부하지 말고 주의를 기울일 필요가 있겠다.

Figure 3. Monoclonal peak in the extreme cathodal gamma region. (A) More than half monoclonal peak out of range. (B) Retest of the same sample exhibited the most of the peak areas are in range. (C) The fully recovered monoclonal peak at the follow-up after one month.

CE 검사의 판독 시, 결과 해석에 앞서서 기본적으로 검사 결과가 잘 얻어졌는지 확인하는 검사 후 검증(post-analytical verification)을 해야함을 항상 염두에 두어야 한다. 이를 위해서는 환자의 이전 결과 및 관련된 결과(총단백, 동형 면역글로불린 정량, 유리경쇄 검사 등의 결과 및 추이)를 잘 살피는 것이 중요하겠다.

3. M단백 외의 자주 관찰되는 이상 피크들

여기서는 저자들의 경험에 따라 비교적 자주 접해본, 그리고 문헌들에서 자주 언급된 이상 피크들에 대해서 기술하겠다. 환자군과 세부적인 검사방법에 따라서 각 이상 피크의 빈도와 전기영동도 양상이 다를 수 있다. 양극부터 음극 쪽 순서로 살펴보겠으며, 조영제와 치료적 단클론항체(therapeutic monoclonal antibody, t-mAb)는 별도로 기술하겠다. 주요 이상 피크의 특징과 조치사항은 Table 1에 정리하였다.

Table 1 Possible causes and required actions for abnormalities due to substances other than endogenous monoclonal immunoglobulin protein (M-protein) occasionally observed in serum protein capillary electrophoresis

Location	Abnormalities*	Possible causes	Practice suggestion
Albumin	Split albumin peak (bisalbuminemia)	Congenital; Acquired (binding of exogenous substance, proteolytic process, etc.)	No action or comment required
Alpha-2	Additional anodic peak	Haptoglobin phenotype variant (Hp 1-1 or 2-1 phenotype)	No action or comment required, generally; If clinical suspicion for monoclonal gammopathy is high, perform immunotyping†
Alpha-2	Cathodic broad shoulder	haptoglobin-hemoglobin complex (mainly due to in vitro hemolysis)	Perform Immunotyping, or resample and retest
Alpha-2 ~ Beta	Additional sharp peak	Iodinated contrast media	Check usage of radiocontrast agent‡, and perform immunotyping or follow-up test
Beta-1	Sharp increase of beta-1 globulin peak	Increased transferrin (iron deficiency anemia); Hemoglobin (hemolysis)	Perform immunotyping
Beta-2	Additional small anodic peak	Increased complement C4	Perform immunotyping
Beta-2	Additional cathodic peak	Fibrinogen (insufficient clotting)	Perform immunotyping, or resample and retest
Gamma	Additional small anodic peak or shoulder	C-reactive protein, complement degradation product, etc.	Perform immunotyping
Gamma	Additional small peak from patient under treatment	Therapeutic monoclonal antibodies: isatuximab in anodal gamma, elotuzumab in mid-gamma, and daratumumab in cathodal gamma region	Check medication history, the patient’s original M-protein peak (location and isotype), and the trend of concentration§

*It is described based on the characteristics observed in the electrophoretogram obtained through the Capillarys 2 Flex Piercing (Sebia), and those obtained by different methods might be somewhat different.

^†Immunosubtraction or immunofixation electrophoresis.

^‡If observed frequently, costs for additional test and time to determine results may be required, and in some cases, additional blood and/or urine collection would be required, causing patient discomfort, so hospital protocols should be established to collect blood and urine before using radiocontrast agents.

^§In the future, it would be necessary to introduce a test method that can differentiate endogenous M-protein and therapeutic monoclonal antibodies.

1) 알부민과 알파1/2 영역

가장 양극성 끝 쪽에서 발견될 수 있는 이상 피크는 항생제인 ceftriaxone으로 인한 것으로, 프리알부민(prealbumin, transthyretin)보다도 더 양극성 위치에 있다(Fig. 4A). 특별한 임상적 의의가 있는 것은 아니지만 AGE에서는 보이지 않는 소견으로, 이러한 200 nm 파장에서 흡광도를 갖는 외인성 물질이 CE에서 검출될 수 있음을 상기시킨다[21]. 알부민은 기본적으로 다양한 물질들과 결합할 수 있고 이에 따라 이동성상의 변화가 생길 수 있다[1]. 각종 약물들과의 결합이나 고지혈증, 고빌리루빈혈증으로 인해 알부민 피크의 늘어짐이나 작은 피크가 보일 수 있다[11]. 두 개의 알부민 피크가 나타나는 비스알부민혈증(bisalbuminemia)도 종종 관찰될 수 있으며(Fig. 4B), 이는 드문 유전적 변이에 의해 선천적으로 발생하거나 종종 외인성 물질과의 결합에 의해, 보다 드물게는 췌장염 환자에서 단백 분해효소 작용에 의해 발생하기도 한다[1, 22]. 알파1 영역에서는 알파1-항트립신(alpha-1 antitrypsin)의 변이나 알파1-산당단백(alpha-1-acid glycoprotein)의 증가로 피크 형태의 이상이 보일 수 있으나, 급성기반응물질(acute-phase reactant)로 넓게 증가하는 것 외에 눈에 띄는 소견이 자주 보이지는 않는다. 보고가 필요한 알파1-항트립신의 결핍은 한국인에서 매우 드문 것으로 생각되나 염두에 둘 필요는 있다[23]. 알파2 영역에서는 합토글로빈(haptoglobin) 표현형 변이에 따라 보다 양극성의 피크가 추가되어 두개의 피크가 보이기도 하며(Fig. 4C), 시험관 내 용혈(in vitro hemolysis)로 인한 합토글로빈-헤모글리빈 복합체로 인해 음극성의 늘어짐이나 피크를 보일 수도 있다. 또한 알파2-마크로글로불린(alpha-2-macroglobulin)이 신증후군 환자에서 굉장히 크게 증가할 수도 있다. 알파2 영역에서 관찰되는 M단백에 대한 보고가 존재하지만 매우 드문 것으로 생각되고 알파2 영역의 피크 이상은 비교적 흔하게 관찰되기 때문에 이들에 대해서 항상 추적 검사나 면역형검사로 확인해 보아야 할지는 고민해 볼 필요가 있다. 다발골수종(multiple myeloma) 환자 1,027명의 혈청단백 전기영동 결과(겔 기반)를 검토한 Mayo Clinic의 보고에서는 이들 중 1%에서 알파2 영역에 M단백이 관찰된 것으로 보고하였는데[24], 저자들의 경험상 알파2 영역에서 관찰되는 M단백은 대개 베타 영역과 가까운 음극성 알파2 영역에서 관찰되었다. 흔히 관찰되는 합토글로빈 표현형 변이나 알파2-마크로글로불린 증가는 알파2 가운데에서 양극성 영역에 나타나므로, 이들에 대해서는 다른 정황상 단클론감마글로불린병증이 강하게 의심되지 않는다면 추가 검사가 반드시 시행될 필요는 없어 보인다[4]. 다만, 보다 음극성의 이상 피크에 대해서는 추가 검사를 시행하여 확인해 볼 필요가 있다.

Figure 4. Various abnormal peaks from substances other than M-protein. (A) Ceftriaxone. (B) Acquired bisalbuminemia. (C) Haptoglobin 1-1 phenotype. (D) Increased complement C4 (C3 107.9 mg/dL, C4 66.1 mg/dL). (E) Fibrinogen from heparin plasma sample. (F) Small peak of unidentified substance in anodal gamma region. (G) Radiocontrast, Xenetix (iobitridol). (H) Radiocontrast, Iomeron (iomeprol). (I) t-mAb, Darzalex (daratumumab), with a concentration of 0.1 g/dL and an M/Tf ratio of 1.280.

2) 베타와 감마 영역

베타 영역부터는 M단백이 종종 나타날 수 있으므로 보다 주의 깊게 살펴볼 필요가 있다. 철결핍성 빈혈에서 트랜스페린의 증가, 또는 용혈로 인한 유리 헤모글로빈으로 인해 베타1 피크가 증가할 수 있으며, 급성기반응 중에 C3 보체 단백의 증가로 베타2 피크가 증가할 수 있다. 이러한 증가는 피크 자체의 형태 이상을 동반하지 않지만, 정상 혈청단백과 함께 이동(comigration)하는 M단백에 의해서도 피크 형태 이상이 동반되지 않은 증가로 나타날 수 있어 되도록 추가 검사의 시행을 통해 확인하는 것이 권장된다[4, 11]. 항생제인 piperacillin/tazobactam이 양극성 베타1 영역에 피크를 보일 수 있는 것으로 보고된 바 있으나, 저자들의 검사실에서는 해당 투약 중인 환자에서 관찰된 적은 없다. 유전적 변이로, 드물지만 한국인도 트랜스페린에서 가장 흔한 C형과 다른 이동성상을 보일 수 있는 B나 D형을 가진 것으로 알려져 있다[25]. 또한 C4 보체 단백의 증가로 C3 피크보다 살짝 양극성 위치에 작은 피크가 보일 수 있으며, IgA나 C3 단백의 상태에 따라 더 두드러져 보일 수 있다 (Fig. 4D). 헤파린 같은 항응고제 치료를 받는 환자나 채혈 과정의 문제로 인해 검체의 응고가 덜 이루어진 경우 섬유소원(fibrinogen) 피크가 C3 피크보다 살짝 음극성 위치에 보일 수 있다(Fig. 4E). 젤라틴 기반의 혈장 대용제는 IgG4연관질환에서 보이는 제한된 다클론성 증가와 흡사한 양상을 베타와 감마 사이 영역에서 보일 수 있다[26]. C-반응단백질(C-reactive protein, CRP)은 정상 농도(<20 mg/L)에서는 전기영동에서 보이지 않지만 높은 농도(>300 mg/L)에서 양극성 감마 영역에 작은 피크로 나타날 수 있는 것으로 보고되었다[11, 14, 27]. C3 보체 단백의 분해산물 또한 양극성 감마 영역에 나타날 수 있는 것으로 보고되었다[14, 28]. 실제로 저자들의 검사실에서도 종종 ISUB에서 M단백으로 확인되지 않는 양극성 감마 영역의 작은 피크가 관찰되지만 그 원인을 정확히 확인하기는 어렵다(Fig. 4F). 두 개 이상의 작은 피크들이 관찰되는 올리고클론성 피크가 관찰될 수 있으며(Fig. 1), 다양한 감염증 및 자가면역질환, 조혈모세포 이식 등이 원인이 될 수 있다[1]. 다만 올리고클론성 피크는 근본적으로 단클론성 피크와 감별이 될 수 없기 때문에 두드러지는 피크가 존재할 경우, 단클론성 유리경쇄가 혈청에서는 적게 존재하나 소변에서 명확하게 보일 수 있으므로, 소변 단백전기영동을 함께 시행하는 것이 좋으며, 3–6개월 후 추적 관찰을 통해 일시적인 것이었는지 M단백 가능성이 높은 지속되는 피크인지를 확인하는 것이 필요하다. 앞서 언급된 다른 베타, 감마 영역의 이상 피크도 의심되는 원인의 전형적인 피크 양상을 보이더라도 M단백을 완전히 배제할 수 없으므로 감별하기 위한 추가 검사의 시행이 권장된다. 또한 낮은 감마글로불린 소견의 경우 혈청에서 정상 베타 피크에 가려졌거나 낮은 M단백의 존재 가능성을 시사하는 소견일 수 있고, 다클론성 증가의 경우 M단백 피크를 가릴 수 있으므로, 추적 검사나 추가 검사의 시행을 통한 확인이 필요할 수 있다[4, 29, 30].

3) 조영제

요오드계 조영제로 인한 이상 피크는 주로 알파2와 베타 영역에서 관찰된다(Fig. 4G, H) [31, 32]. 요오드계 조영제는 소변으로 빠르게 배설되기 때문에 보통 하루정도 지나면 검출되지 않지만 신기능 저하 등의 경우에 따라 더 길게 남아있을 수도 있으므로, 되도록이면 조영제 사용 전에 채혈을 하는 것이 바람직하다[33]. 검출된 경우라 하더라도 M단백으로 오해하여 보고하지 않고 추가 검사로 확인하면 감별할 수 있으므로 크게 문제되지는 않는다. 다만 실제 M단백이 동반된 환자의 경우 M단백 정량 시에, 특히 조영제 피크가 크게 나타나는 소변에서 단백 전기영동을 이용한 정량시에 크게 영향을 줄 수 있으므로 주의가 필요하다. 조영제가 총단백 정량 검사에도 영향을 주므로 보다 정확한 M단백 정량을 위해서는 다시 채뇨하여 검사하는 것이 바람직하다. 만일 불가피하게 M단백 분율을 추정하여 보고해야 한다면, 오해를 줄이기 위해서는 분모에서 조영제 영역의 값을 빼고 다시 계산하는 것이 좋다. 저자들의 검사실에서 경험한 사례를 보면, 24시간 소변에서 조영제 피크로 인해 M단백에 대한 곡선하면적 백분율이 4.1%로 과소추정되지만, 분모에서 조영제 영역의 값(67.3%)을 빼고 다시 계산하면 12.5% (=4.1/[100–67.3]×100)로, 조영제 사용 전 채뇨된 임의뇨에서 추정한 13.5%와 거의 비슷하였다(Fig. 5).

Figure 5. Coexistence of radiocontrast agent and M-protein in urine. (A) Abnormal peaks caused by radiocontrast agent (#1) and M-protein (#2) in 24 hr urine collected after the agent injection. (B) M-peak from spot urine sample collected before the agent injection.

4) 치료적 단클론항체(t-mAb)

감마 영역에서 t-mAb로 인한 이상 피크가 관찰될 수 있다(Fig. 4I). 앞서 언급된 이상 피크들이 면역형검사 추가 검사를 통해 충분히 감별될 수 있는 반면, t-mAb를 환자의 종양세포에서 유래된 M단백과 감별하기 위해서는 질량분석기, anti-idiotype antibodies를 이용한 방법, 또는 표적 항원을 이용해 제거하는 방법 등 특수한 검사법을 활용해야 한다[34-37]. 하지만 아직 그러한 방법들이 임상검사실에서 손쉽게 활용되기는 어렵고, Sebia에서 개발한 anti-idiotype antibody를 이용한 방식인 Hydrashift 제품도 아직 국내 인허가가 이루어지지 않은 상황이다[38]. 따라서 아직은 환자의 투약력 및 과거 전기영동 결과에서 보이는 M단백 위치 등의 정보를 이용해 감별해야 한다. 다발골수종 환자의 치료에 쓰이는 항-CD38 단클론항체인 daratumumab이 주로 전기영동 결과 해석에 어려움을 주고 있다. 다발골수종에 쓰이는 isatuximab과 elotuzumab 등의 다른 t-mAb들도 간섭을 일으키는 것으로 보고되었지만 국내에서 급여화되어있지 않고 실제 사용이 거의 이루어지지 않아 해당 간섭을 접하게 될 가능성은 낮다. 하지만 임상시험 약제로 투약중인 환자가 드물게 있을 수 있어 치료 중인 환자에게서 작은 피크가 발견된 경우 투약력을 유심히 살펴볼 필요가 있다. 전기영동도상에서 병적 M단백과 daratumumab의 감별 시 daratumumab의 위치를 단순히 음극성 감마 영역이라고만 인지하고 판단하는 것은 다소 부정확할 수 있고, CE의 기본 좌표값은 변동이 다소 있을 수 있기 때문에 트랜스페린의 좌표값을 기준으로 위치값을 정규화하는 방법이 제시된 바 있다[39]. 여기서 정규화된 위치값을 구하는 방법은 트랜스페린 피크의 X 좌표값으로 daratumumab 혹은 M단백 피크의 X 좌표값을 나누는 것이다(M/Tf ratio). 해당 연구에서는 Sebia Capillarys 2 장비를 이용하여 11명 환자의 64개 검체에서 daratumumab의 정규화된 위치값을 측정하였을 때 평균(범위) 1.285 (1.274–1.296)의 값을 보였다. 저자들의 검사실에서도 daratumumab 투약중인 환자들을 대상으로 계산해보면 M/Tf ratio 값이 비슷한 범위를 보이며, 점차 정량값이 증가하거나 M/Tf ratio 값이 다른 피크가 나타나면 보다 강하게 재발을 의심하고 있다. 경험한 한 환자 사례를 살펴보면, 진행성 질환(progressive disease) 경과를 보이던 환자로, 원래 M단백이 IgG kappa 형이고 M/Tf ratio는 1.345로 daratumumab보다 약간 더 음극성 이동성상을 보였다(Fig. 6A). Daratumumab을 포함한 항암치료 후 아주 좋은 부분반응(very good partial response)을 보이며 CE상에서 M단백이 관찰되지 않는 상태로 있었는데(daratumumab으로 생각되는 피크가 아주 희미하게 보이는 정도), 다시 비교적 명확한 음극성 감마 피크가 보이기 시작하였고 daratumumab보다는 원래 환자의 M단백 피크에 더 가까운 M/Tf ratio를 보여 재발을 의심하였다(Fig. 6B). 이후 몇 차례 더 항암치료를 받았으나 지속적으로 해당 피크의 면적이 증가하였고, 마지막 투약 2개월 후 추적 검사에서 확연히 증가한 피크를 보였다(Fig. 6C). 이렇듯 피크의 정량적 추세와 M/Tf ratio를 통해 어느정도 t-mAb와 병적 M단백의 구분은 가능하겠으나 이는 불완전하며, t-mAb의 적응증이 확대되는 추세이므로 조속히 둘을 감별할 수 있는 검사법의 국내 임상검사실에의 도입이 요구된다.

Figure 6. Case of re-emergence of M-protein during daratumumab treatment. (A) The original M-peak before daratumumab treatment (M/Tf ratio= 1.345; M-protein conc.=2.7 g/dL). (B) Reappeared M-peak — although closer to the original M-peak than the peak of daratumumab, cannot be clearly discriminated (M/Tf ratio=1.338; M-protein conc.=0.12 g/dL). (C) Obvious increase in M-protein concentration (M/Tf ratio=1.337; M-protein conc.=0.44 g/dL) observed two months after the last dose of daratumumab.

4. 성능에 대한 고찰

혈청단백 전기영동 검사의 성능은 검사의 해석에 판독자의 주관성이 개입되고 세부 방법에 따라 성능이 다르게 나타날 수 있어서 단편적으로 평가하기 어렵다. 초기의 임상적 성능평가 문헌들부터 최근의 문헌들까지 CE는 AGE보다 M단백 검출의 민감도가 우수한 것으로 보고되어 왔다[40-42]. 이는 베타1과 베타2 피크를 구분하는 고해상도의 AGE와 비교하였을 때도 마찬가지였다[43]. 다른 연구들에서는 낮은 특이도로 인하여 불필요한 추가 검사를 유발하는 점과[44, 45], 판독자 간 일치도가 낮은 점 등의 문제점이 부각되기도 하였다[46]. 최근에 Sebia의 최신 CE 장비인 Capillarys 3 Tera와 AGE 장비인 Hydrasys 2를 비교한 연구에서도 8일간 의뢰된 일상 임상검체로 평가하였을 때 CE가 AGE보다 민감도는 높고 (76% vs. 73%) 특이도는 낮았으며(92% vs. 95%), ROC 곡선하 면적은 0.84 정도로 거의 동일하였다[42]. 최근의 다기관 연구를 통해 드러난 분석성능도 CE의 검출한계가 AGE와 비교해 동등하거나 경우에 따라 보다 낮은 것으로 나타났다[2]. 종합적으로 볼 때, CE는 M단백의 검출에 있어서 일반적으로 AGE에 비해 보다 민감하지만 덜 특이적이다. 낮은 특이도는 앞서 언급된 CE에서 자주 보이는 보체 단백의 분해산물이나 CRP에 의한 것으로 추정되는 양극성 감마 영역의 작은 피크나, 비특이적으로 관찰되는 감마글로불린 피크의 치우침이나 도드라짐이 M단백으로 오인되기 때문인 것으로 보인다[14, 43, 44]. 혈청단백 전기영동이 단클론감마글로불린병증 의심환자의 1차 검사로 활용된다는 점을 생각하면[47], 다소 낮은 특이도를 보이더라도 높은 민감도는 장점으로 작용할 수 있다고 생각한다.

혈청단백 전기영동 검사를 통한 M단백의 정량은 다발골수종의 진단과 예후 평가 및 치료반응 평가에 중요한 역할을 한다[48, 49]. 최근의 다기관 연구에서 밝힌 CE와 AGE 간의 M단백 정량한계(80–120% 이내의 평균 recovery와 CV ≤20%를 보이는 최저농도로 정의한)의 차이는 다른 요인에 따른 차이에 비해 크지 않다[50]. M단백 정량의 재현성 측면에서 검사실 내 정밀도는 CE와 AGE 간에 유의한 차이가 없는 것으로 보이며[2], 검사실 간 정밀도도 수가 많은 검사법 그룹 간에 비교해 보면 큰 차이가 없어 보인다[50]. CE와 AGE 간의 정량값 차이는 세부 검사법에 따라 다르게 나타나므로 일률적으로 말하기는 어렵지만, Sebia의 CE는 동사의 AGE와 비교하여 낮은 M단백 농도 구간에서 상대적으로 더 높은 값을 보인다[14, 50]. 혈청단백 전기영동 검사를 통한 M단백의 정량은 이러한 검사법 간의 차이뿐만 아니라 판독자의 정량 방식에 크게 영향을 받음에 유의하여야 한다. 정량을 위해 피크의 영역을 규정하는 방식으로는 수직내림법(perpendicular drop, PD)과 접선절삭법(tangent skimming, TS) 방식이 주로 이용되고 있다. 이 중 PD 방식은 회수율(recovery)이 100%보다 크고(양성 바이어스), 다클론성 감마글로불린 농도가 높아지거나 M단백 농도가 낮아짐에 따라 회수율이 더 커지는 경향을 보인다. 반면 TS 방식은 회수율이 100% 보다 작고(음성 바이어스), 다클론성 감마글로불린 농도나 M단백 농도에 영향을 덜 받는다[50]. 한 환자에 대한 M단백 정량값을 적절히 추적 관찰하기 위해서는, 기본적으로 동일한 검사실에서 동일한 검사법으로 검사를 하는 것이 권장되며[51, 52], 더불어 한 검사실에서 여러 명의 판독자가 판독하는 경우 정량 방식을 최대한 동일하게 맞추어 검사실 내 변동성을 줄일 필요가 있다.

AGE와 CE에 결합된 보편적 면역형검사 방식인 IFE와 ISUB의 성능에 대해서는 혈청단백 전기영동에서 명확히 보이는 M단백의 형을 결정하는 데는 이 둘이 동등하지만, 적은 양의 M단백을 검출하는 데는 ISUB이 IFE에 비해 다소 덜 민감하다는 의견이 제시되어 왔다[12, 46, 53]. 하지만 이러한 성능평가 결과에는 검사법 자체의 특성뿐만 아니라 판독자의 숙련도가 큰 영향을 줄 수 있다[46]. 최근의 한 연구에서는 판독자들에 대한 적절한 교육을 통해 임상정보를 가린 상태의 판독을 통한 M단백 검출 민감도가 평균 69%에서 88%로 향상되었다고 보고하였으며, 숙련된 판독자에 의한 ISUB의 민감도는 IFE와 동등하다고 주장하였다[54]. 또한 ISUB의 단클론성 유리경쇄(monoclonal free light chain)에 대한 민감도는 IFE에 비해 낮을 수 있지만 유리경쇄 검사와 동반하여 검사할 경우의 통합 민감도는 IFE와 동등하다고 보고된 바 있다[55]. 최근에 CAP에서 제시한 단클론감마글로불린병증 진단 지침에서도 절대표준(gold standard)은 여전히 IFE이고 높은 수준의 근거로 ISUB의 동등성을 확인하지는 못하였지만 혈청단백 전기영동에 대한 확인 검사로서 IFE의 대체제로 ISUB을 활용 가능한 것으로 기술하고 있다[47]. 경험적으로 볼 때, 저감마글로불린 배경에서 낮은 농도의 M단백을 검출하는 것은 IFE가 보다 민감하며, 트랜스페린이나 C3 단백과 함께 이동하는 경우도 IFE가 판독하기 편하지만, 고감마글로불린 배경에서는 ISUB이 보다 판독하기 편하다. 각각의 장단점이 있기 때문에, 현재로서는 ISUB과 IFE를 상호 보완적으로 활용하는 것이 바람직할 것으로 보이며, 가능한 예로서 검사가 편리한 ISUB을 우선적으로 시행 후 ISUB 결과가 애매하거나 임상상과 맞지 않는 경우 IFE로 확인하는 방법 등이 있겠다.

검사 원리와 기술적 특성을 이해하는 것은 CE 검사상의 다양한 문제의 해결과 결과의 검증에 도움이 된다. CE의 전기영동도에서는 M단백 외의 다양한 이상 피크를 보일 수 있으므로 이들의 특성을 이해하고 이상 결과에 대해 적절히 대응하여야 한다. CE와 ISUB의 임상성능은 판독자의 숙련도에 영향을 크게 받으므로 판독자 교육에 대한 학회와 수련기관의 지속적인 노력이 필요하다.

저자들은 본 연구와 관련하여 어떠한 이해관계도 없음을 밝힙니다.